Cours biochimie analytique partie Chromatographie en Phase Gazeuse (CPG)
La chromatographie en phase gazeuse (CPG) est une technique analytique utilisée pour séparer et analyser des composés volatils ou gazeux dans un échantillon complexe. Elle repose sur la séparation des composants d'un mélange en fonction de leur affinité relative pour une phase mobile gazeuse et une phase stationnaire.
Principe de la Chromatographie en Phase Gazeuse
La phase mobile dans la CPG est un gaz, généralement de l'hélium ou de l'azote, qui transporte les échantillons injectés dans une colonne chromatographique. La phase stationnaire, qui est généralement un liquide ou un solide adsorbant, est fixée à l'intérieur de la colonne. Le temps nécessaire pour qu'un composé traverse la colonne (temps de rétention) dépend de ses interactions avec la phase stationnaire, ce qui permet de séparer les composants du mélange.
Composants principaux de la CPG
- Injecteur : C’est l’endroit où l’échantillon est introduit dans le système. Il est souvent maintenu à une température élevée pour volatiliser l’échantillon.
- Colonne chromatographique : Elle est la partie principale de la CPG. Elle peut être capillaire ou tubulaire, et remplie soit d'un liquide, soit d'un matériau solide comme le silicagel, sur lequel la phase stationnaire est fixée.
- Détecteur : Le détecteur mesure la quantité de chaque composé séparé au fur et à mesure de son passage dans la colonne. Les détecteurs courants incluent le détecteur à ionisation de flamme (FID), le détecteur à capture d'électrons (ECD), et le détecteur de conductivité thermique (TCD).
- Système de chauffage : Pour maintenir la colonne et l'injecteur à température constante et pour garantir une volatilisation complète des échantillons.
Applications de la Chromatographie en Phase Gazeuse
La CPG est utilisée pour analyser des composés volatils dans divers domaines, notamment :
- Analyse des gaz : Mesure des concentrations de gaz dans l’air ou dans des mélanges gazeux (ex. analyse des gaz d’échappement, analyse des composés organiques volatils dans l’air).
- Contrôle de la qualité des produits : Identification et quantification des contaminants dans des produits alimentaires, cosmétiques, ou pharmaceutiques.
- Analyse des produits pétroliers : Détermination des différents hydrocarbures présents dans le pétrole brut ou les produits raffinés.
Avantages de la CPG
- Très sensible et précise pour l’analyse des composés volatils.
- Permet de séparer des mélanges complexes de manière rapide.
- Applications multiples, allant de l’analyse environnementale à l’analyse des produits chimiques.
Limites de la CPG
- Non applicable aux composés non volatils ou thermiquement instables.
- Nécessité d'un échantillon sous forme gazeuse ou facilement volatil.
Partie 2 : Chromatographie Liquide (HPLC)
La chromatographie liquide à haute performance (HPLC) est une technique chromatographique qui permet de séparer les composants d’un mélange liquide en fonction de leur interaction avec une phase stationnaire et une phase mobile liquide. L’HPLC est très couramment utilisée pour l’analyse de composés non volatils ou thermiquement sensibles, tels que les acides aminés, les protéines, et les médicaments.
Principe de la Chromatographie Liquide
Dans l’HPLC, l’échantillon liquide est injecté sous haute pression dans une colonne remplie de matière solide ou de gel (phase stationnaire). Une phase mobile (liquide) circule à travers la colonne, et les composants de l’échantillon interagissent différemment avec la phase stationnaire, ce qui les sépare. Chaque composé prend un temps différent pour traverser la colonne (temps de rétention), et cette différence est utilisée pour la séparation.
Composants principaux de l'HPLC
- Pompe : La pompe pousse la phase mobile (solvant ou mélange de solvants) à travers la colonne sous haute pression. La pression est généralement de 50 à 5000 psi (livres par pouce carré).
- Injecteur : L’échantillon est introduit dans le système à l’aide d’un injecteur automatique ou manuel.
- Colonne chromatographique : La colonne est le cœur de l’HPLC. Elle peut être remplie de particules solides ou d’un gel polymère. Les types de colonnes courantes sont la colonne C18 (silice modifiée), la colonne échangeuse d'ions, et la colonne de gel filtrant.
- Détecteur : Après séparation, les composants du mélange sont détectés par un détecteur. Les détecteurs courants incluent le détecteur UV-Vis, le détecteur de fluorescence, le détecteur de conductivité, et le détecteur de réfraction.
- Système de contrôle : Il régule les conditions opératoires, telles que la température de la colonne, le débit de la phase mobile, et le type de solvants utilisés.
Types de Chromatographie Liquide
- Chromatographie en phase normale : La phase stationnaire est polaire (ex. silice) et la phase mobile est moins polaire (souvent un solvant non polaire). Ce mode est utilisé pour séparer des composés polaires.
- Chromatographie en phase inverse : La phase stationnaire est non polaire (ex. C18), et la phase mobile est polaire. Ce mode est utilisé pour séparer des composés non polaires.
- Chromatographie d'échange d'ions : Utilise une colonne où la phase stationnaire contient des groupes chargés. Elle est utilisée pour séparer des ions, comme les acides aminés ou les protéines.
- Chromatographie d’exclusion par la taille : Sépare les molécules en fonction de leur taille (utilisée pour les protéines et les polymères).
Applications de l'HPLC
L’HPLC est utilisée dans de nombreux domaines, tels que :
- Analyse de médicaments : Quantification et identification des médicaments dans les formulations pharmaceutiques.
- Analyse de la nourriture et des boissons : Détection des conservateurs, des colorants alimentaires, des additifs, et des contaminants.
- Analyse des biomolécules : Séparation des protéines, peptides, et acides nucléiques dans les recherches biomédicales.
- Tests environnementaux : Analyse des polluants dans l’eau, l’air, et le sol.
Avantages de l'HPLC
- Séparation rapide et efficace des composés complexes.
- Large gamme d'applications allant des petites molécules aux macromolécules.
- Haute sensibilité et précision.
- Large variété de colonnes et de conditions opératoires.
Limites de l'HPLC
- Nécessité d’une préparation minutieuse de l’échantillon (dissolution dans la phase mobile, filtration).
- Coût des réactifs et des consommables.
- Nécessité d’un entretien régulier de l'équipement pour éviter l'encrassement des colonnes.
Comparaison entre CPG et HPLC
| Caractéristique | CPG | HPLC |
|---|---|---|
| Phase mobile | Gaz (hélium, azote, etc.) | Liquide (solvants organiques, eau) |
| Type de séparation | Composés volatils et gazeux | Composés non volatils, solubles |
| Type d'échantillons | Gaz ou composés volatils | Liquides (solutions, extraits, etc.) |
| Détecteurs courants | Ionisation de flamme, capture d’électrons | UV, fluorescence, réfraction, conductivité |
| Applications principales | Analyse des gaz, produits pétroliers, environnement | Analyse des biomolécules, médicaments, produits alimentaires |
Conclusion
La chromatographie en phase gazeuse (CPG) et la chromatographie liquide à haute performance (HPLC) sont des techniques essentielles en biochimie analytique pour séparer, analyser et quantifier divers composants chimiques. La CPG est idéale pour les composés volatils, tandis que l'HPLC est plus adaptée aux composés non volatils et aux biomolécules. Ces deux méthodes ont des applications larges et variées dans les domaines de la pharmacologie, de l'alimentation, de l'environnement et des sciences biomédicales.